Columnas de Anexinas V como metodología de selección molecular de espermatozoides

Dra. Vanesa Rawe (vanesa.rawe@gmail.com)
Revista Reproducción Humana, Año 2009.

Importancia del estudio de la patología espermática

La calidad de los espermatozoides es uno de los factores que determinan el éxito de las técnicas de reproducción asistida. Desde el nacimiento de la primera bebé por Fertilización in Vitro (FIV), quedó establecido que la unión in vitro de gametas humanas podía generar un embrión y embarazo viable (Steptoe y Edwards, 1978).

En la década de los 90’, la introducción de la Inyección Intracitoplásmica de Espermatozoides (ICSI) revolucionó la medicina reproductiva (Palermo y col., 1995) y el estudio del factor masculino pareció perder validez ya que se tendía a pensar que la inyección intracitoplásmica de casi cualquier espermatozoide generaba embarazo. Un tiempo más tarde, el estudio profundo del espermatozoide por técnicas de biología celular y molecular más sofisticadas, permitió identificar los trastornos subyacentes en la gameta masculina y el diagnóstico patológico ganó nuevo reconocimiento. Nació de esta manera el estudio de la patología de las gametas y cómo ésta impacta en los resultados de reproducción asistida (Chemes y Rawe 2003, 2006).

Estudio de apoptosis en espermatozoides

Recientemente, estudios sofisticados de biología celular, han permitido profundizar el estudio del varón, permitiendo ver algunos problemas no detectados por el espermograma básico. Entre esos estudios se encuentra la apoptosis en espermatozoides.

¿Qué es la apoptosis y qué marcadores se estudian?

La apoptosis es el evento de “muerte celular programada” e involucra a una serie de mensajeros intracelulares que se activan y terminan en la fragmentación del ADN. Dentro de esos marcadores de apoptosis podemos mencionar a los “tempranos” como la exposición de fosfatidiserina y los “tardíos” como la activación de Caspasa 3  y la fragmentación del ADN.

¿Qué es la fragmentación del ADN espermático y cuál es su importancia?

La fragmentación del ADN espermático, tal y como indica su nombre, se refiere a roturas o lesiones en el material genético del espermatozoide. A mayor número de lesiones, menor será la integridad del material genético y las probabilidades de que se produzca un embarazo a término.

¿En qué casos es recomendado el estudio de apoptosis?

Es recomendado en los hombres con algún trastorno andrológico como ser: varicocele, testículos en ascensor, edad avanzada (mayor de 45 años), teratozoospermia severa (índice de Kruger mayor a 4%), con tratamiento de quimio o radioterapia, con intentos previos de reproducción asistida con fallas de fertilización o embriones de mala calidad, y casos de pérdidas gestacionales tempranas.

¿Cómo se detectan los niveles de apoptosis espermático?

Nosotros acoplamos la medición de la Caspasa 3 activa  con la medición de la fragmentación en el ADN espermático. De esta manera cubrimos los aspectos más importantes de la apoptosis desde que se desencadena de manera irreversible. Existen varios métodos para medir los niveles de fragmentación del ADN.  El test de TUNEL, que es el test recomendado por líderes de opinión en estudios de fragmentación de ADN.

El test TUNEL mide daño real y tiene un alto valor predictivo en técnicas de reproducción asistida. Actualmente el valor de corte de normalidad recomendado para el test TUNEL es menor al 20%. Para la medición de la Caspasa 3, realizamos la técnica de inmunocitoquímica y la proteína se visualiza en el cuello (pieza media) de los espermatozoides. Los valores normales esperados son menores al 11%.

Alternativas terapéuticas

En los últimos años, han surgido distintas alternativas para tratar de brindar mejores resultados reproductivos a pacientes con altos niveles de espermatozoides con ADN fragmentado.

En búsqueda de un método no invasivo que permita dar solución a los altos niveles de apoptosis celular en espermatozoides, distintos grupos de trabajo describieron el uso de Anexina V acoplada a pequeñas esferas metálicas (aproximadamente 50 nanometros de diámetro) recubiertas por un polímero biodegradable. Las mismas pueden ser usadas para separar espermatozoides muertos y apoptóticos cuando se los expone a un campo magnético de alto poder en una columna.  Este procedimiento de separación o filtrado molecular se denomina “Magnetic Activated Cell Sorting- MACS-” o Separación Magnética por Columnas de Anexina V.

¿Cómo funcionan las Columnas de Anexinas V?

Ante un diagnóstico de apoptosis anormal en espermatozoides, existe un alto porcentaje de células que exponen en su membrana plasmática un fosfolípido llamado fosfatidilserina.

La fosfatidilserina tiene afinidad por Anexina V. Si Anexinas V están adheridas a microesferas de metal recubiertas de un polímero biodegradable y se las incuba con la muestra afectada, se formará el siguiente complejo:

Si a esta muestra se la hace interaccionar por segundos con un magneto de alto poder, los espermatozoides afectados quedarán adheridos a las paredes de la columna y los no afectados fluirán para luego ser recuperados y utilizados durante una técnica de reproducción asistida.

¿Qué resultados se han obtenido hasta el momento?

Luego de la realización de estudios de EFICACIA y SEGURIDAD en un grupo de pacientes con alto grado de apoptosis en espermatozoides, pudimos obtener valores de TUNEL y CASPASA 3 activa dentro de los esperados para un hombre fértil.

Es decir, hemos logrado disminuir los valores de fragmentación del ADN espermático en todos los casos analizados.

De esta manera, logramos enriquecer la muestra en espermatozoides no apoptóticos, ofreciendo al paciente más posibilidades para la formación de un embrión con mayor potencial de implantación y embarazo luego del ICSI.

Luego de la realización de un estudio recientemente presentado en el noveno taller de la Red Latinoamericana de Reproduccion Asistida en Cancún, México, se han logrado excelentes tasas de fecundación y promisorias tasas de embarazo luego del uso de muestras seleccionadas con Columnas de Anexinas V.

A pesar de que restan realizar estudios prospectivos y randomizados para que esta nueva metodología sea considerada una sólida alternativa terapéutica, se demuestra la ventaja de la filtración molecular en la separación de espermatozoides apoptóticos para la optimización de los resultados de ICSI en los pacientes afectados.